新型長循環(huán)脂質(zhì)體的研制實驗

長循環(huán)納米脂質(zhì)體作為難溶性藥物載體，因具有體內(nèi)長循環(huán)、靶向、保護(hù)、高效低毒等特性，極大地解決了脂質(zhì)體作為納米給藥載體的不足而倍受青睞，是很有發(fā)展前景的藥物載體。

長循環(huán)納米脂質(zhì)體又被稱立體穩(wěn)定脂質(zhì)體，它是在普通脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上加入一定比例的衍生物，使表面暴露出一些親水性的多糖或多羥基基團(tuán)等，從而減少了與血漿中的成分結(jié)合，增加了脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性，從而延長了藥物在血液中的作用時間，使藥物有更充足的時間到達(dá)靶向部位，增強(qiáng)藥物的治療效果。現(xiàn)在常用的長循環(huán)納米脂質(zhì)體的修飾物有：神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、聚乙二醇(PEG)、非離子表面活性劑及其類脂衍生物等。其中PEG及其類脂衍生物因具有無免疫毒性且來源廣泛等優(yōu)點，目前已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)上常用的長循環(huán)脂質(zhì)體表面修飾物，其主要包括PEG-DSPC、PEG-PE、PEG-DSPE、PEG-PC等。被修飾后的脂質(zhì)體可因PEG分子中大量的親水基團(tuán)與水結(jié)合構(gòu)成空間位阻，降低吞噬細(xì)胞的破壞與吞噬的幾率，延長有效成分在血液中的滯留時間，使其血藥濃度較長時間的作用于靶器官中，使藥物的治療效果明顯提高。長循環(huán)納米脂質(zhì)體存在以下優(yōu)點：因脂質(zhì)體的粒徑為納米級別，注射長循環(huán)納米脂質(zhì)體后被包裹的藥物更易透過細(xì)胞膜，采用PEG對脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾，使脂質(zhì)體具備長循環(huán)和立體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的特點，對減少肝臟巨噬細(xì)胞對藥物的吞噬，維持平穩(wěn)的血藥濃度，提高藥物靶向性和生物利用度、延長藥物在體內(nèi)循環(huán)時間等具有重要作用和意義。

為了使長循環(huán)脂質(zhì)體制劑更好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和臨床，國內(nèi)外學(xué)者對脂質(zhì)體制備工藝的進(jìn)行了深入的研究，研制出了多種的新型長循環(huán)脂質(zhì)體，包括長循環(huán)磁性脂質(zhì)體、長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體、長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體、長循環(huán)免疫脂質(zhì)體等。新型長循環(huán)脂質(zhì)體的研制將為復(fù)方長循環(huán)脂質(zhì)體的進(jìn)一步開發(fā)提供新的思路與方向。

實驗設(shè)備：

Agilent-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；

CP2250分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠)；

SHB-Ⅲ真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；

WST-NANO；

高速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司）；

5200H超聲波清洗器（上海科島超聲儀器有限公司）；

DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器(浙江省樂清縣樂成電器廠)

實驗步驟與結(jié)果：

1三種長循環(huán)脂質(zhì)體制備方法：

為了獲得粒徑較小的納米級的脂質(zhì)體，本實驗選取了的三種常用制備脂質(zhì)體的方法并且聯(lián)合微射流均質(zhì)技術(shù)進(jìn)行比較，分別為薄膜分散-微射流均質(zhì)法、乙醇注入-微射流均質(zhì)法和逆相蒸發(fā)法-微射流均質(zhì)法，采用3種不同的方法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，通過比較制得的長循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率及粒徑大小對其進(jìn)行評價。

1.1 薄膜分散-微射流均質(zhì)法

精密稱取蟾酥提純物5.20mg，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，溶解于100mL氯仿中，置于減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸（45℃，100r/min）直至氯仿蒸干。然后加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）于圓底燒瓶中進(jìn)行洗膜，經(jīng)恒溫水化10min，進(jìn)行超聲30min，采用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對所制備的蟾酥提取物長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)，過0.22μm微孔濾膜整粒，即為蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體溶液。

1.2 乙醇注入-微射流均質(zhì)法

精密稱取蟾酥提純物物5.20mg，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，溶于100mL乙醇作為有機(jī)相，pH6.8的PBS緩沖液作為水相，在1200r·min－1的攪拌轉(zhuǎn)速下，將有機(jī)相勻速緩慢滴入50℃保溫水相中，繼續(xù)攪拌2h，揮去乙醇，超聲30min，用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對所得混懸液進(jìn)行均質(zhì)，過0.22μm微孔濾膜整粒，即得蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體混懸液。

1.3 逆向蒸發(fā)-微射流均質(zhì)法

精密稱取蟾酥提純物5.20mg加入到50mLpH7.0的PBS緩沖液，作為水相，精密稱取成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，加入50mL氯仿使其溶解。將水相加入到有機(jī)相中，超聲處理5min，得W/O乳劑,置減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于恒溫45℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，得稠厚的膠狀物，于干燥箱中室溫條件下放置4h，加入50mLpH6.8的PBS緩沖溶液，洗膜，進(jìn)行超聲30min，采用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對所制備的長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)，過0.22μm微孔濾膜整粒，即得蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體混懸液。

結(jié)果

1. 長循環(huán)脂質(zhì)體外觀

采用超速離心法測定制備的蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體得包封率，14000r/min離心30min，分離游離藥物和含藥脂質(zhì)體，測定其包封率和粒徑。通過比較所測得的包封率和粒徑大小來選取制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體方法，具體結(jié)果見下表1。

制備方法對長循環(huán)納米脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響

從上表中可以看出，由于均采用與微射流均質(zhì)法聯(lián)合應(yīng)用，三種制備方法所制得的蟾酥長循環(huán)納米脂質(zhì)體的粒徑差別并不明顯，而測得的包封率有較大的差別，采用薄膜分散法制備的長循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率最大，其次是乙醇注入法，而逆向蒸發(fā)法最小。三種方法均結(jié)合微射流均質(zhì)法測得的粒徑最小的為薄膜分散法，綜合包封率和粒徑2個評價指標(biāo)，最終最終選擇薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥長循環(huán)納米脂質(zhì)體

長循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝單因素考察

本實驗采用薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，以包封率為主要評價指標(biāo)，以形態(tài)外觀為參考，選取有機(jī)溶劑的種類、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、DSPE-mPEG2000的用量、水化溫度、超聲時間、微射流壓力作為單因素考察。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響較大的因素作為主要因素，采用星點設(shè)計—效應(yīng)面法對蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體的工藝進(jìn)行優(yōu)化。本

其中：微射流均質(zhì)壓力對包封率的影響

固定制備條件：卵磷脂：蟾酥提取物（7:1）；卵磷脂：膽固醇（3:1）；超聲時間40min；水化溫度65℃；加入50mL的氯仿有機(jī)溶劑；磷酸鹽緩沖液PH=6.8；加入5%DSPE-mPEG2000；減壓旋蒸溫度43℃。變化條件：微射流壓力，分別為60MPa、80MPa、100MPa、120MPa、140MPa。

方法：采用薄膜分散法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，結(jié)合微射流均質(zhì)法減小其粒徑，測定其包封率，具體結(jié)果見下表2。

不同微射流壓力對包封率的影響

實驗結(jié)果表明，微射流儀壓力對包封率也存在著影響，當(dāng)壓力超過100MPa時，脂質(zhì)體包封率減小，原因可能是過大的壓力導(dǎo)致脂質(zhì)體破壞，破乳所致，因此本實驗選擇微射流儀壓力為100MPa。

其他單因素檢測細(xì)節(jié)：略

星點設(shè)計優(yōu)化蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體處方與工藝單因素試驗結(jié)果表明，超聲時間（X1）、卵磷脂：蟾酥提取物（X2）、卵磷脂：膽固醇（X3）對蟾酥長循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率有較大影響。因此在單因素實驗考察的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點設(shè)計-效應(yīng)面原理，將較為顯著的3個因素作為自變量，z高水平設(shè)定為：X1為50min；X2為9:1；X3為4:1，z低水平設(shè)定為：X1為30min；X2為5:1；X3為2:1，以包封率（Y）為因變量，優(yōu)化蟾酥長循環(huán)納米脂質(zhì)體的處方與工藝。

Box-Behnken試驗結(jié)果分析應(yīng)用DesignExpert8.0軟件對表3-11工藝優(yōu)化試驗因素水平的試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得二次多項回歸模型方程Y=86.16－0.33A—1.18B+1.60C－0.42AB+0.55AC+1.38BC－1.50A2－2.09B2－1.50C2，R2=0.9518。模型的R2與1較接近，說明通過二次回歸得到的模型與試驗擬合較好。同時，響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果顯示：模型F=15.37，P0.05)，不顯著，因此二次模型成立。

影響脂質(zhì)體包封率的主要因素分析包封率模型(Y)回歸方程的方差分析表明B，C，BC，A2，B2，C2項達(dá)極顯著水平(P<0.01)，交互項AB和AC的P分別為0.3189，0.2022，均大于0.05，所以交互項AB和AC對顆粒的一次成型率沒有顯著性影響。通過F值大小可以判斷，選取的3個主要因素對包封率影響大小依次為，磷脂：膽固醇（X3）>磷脂：蟾酥提取物（X2）>超聲時間（X1）

優(yōu)化處方驗證蟾酥長循環(huán)納米脂質(zhì)體的最佳制備工藝為：

精密稱取蟾酥提取物20mg，大豆卵磷脂140mg，膽固醇40mg，DSPE-mPEG20009mg，溶于100mL氯仿中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓旋蒸（43℃，100r/min），有機(jī)溶劑氯仿全部除去的同時，燒瓶內(nèi)壁上會形成一層白色薄膜。此時加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）洗膜，再依次經(jīng)60℃恒溫攪拌水化20min，超聲40min，設(shè)定genizer微射流均質(zhì)機(jī)壓力為100MPa，對所得混懸液進(jìn)行均質(zhì)，混懸液于14000r/min離心1h，分離游離藥物和含藥脂質(zhì)體，測定其包封率。根據(jù)最佳制備工藝制備三批蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，分別測定華蟾酥毒基與脂蟾毒配基總含量的包封率。具體結(jié)果見表3。

工藝驗證結(jié)果

討論與小結(jié)

脂質(zhì)體制備方法有多種，實驗中選用薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法結(jié)合微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，以包封率和粒徑作為考察指標(biāo)，選取理想的制備方法。

實驗結(jié)果表明，選取的三種制備方法對粒徑結(jié)果影響較小，而對包封率的影響較為明顯。采用薄膜分散法制備的長循環(huán)納米脂質(zhì)體包封率最高，其次是乙醇注入法，z低的是逆向蒸發(fā)法，因為此法對水溶性藥物包封率較高，而蟾酥中的華蟾毒配基和脂蟾毒配基于脂溶性成分，因此逆向蒸發(fā)法制得的蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率低。且考慮到薄膜分散法工藝簡單，測定包封率較高，因此選用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，但僅使用薄膜分散法制得的長循環(huán)納米脂質(zhì)體粒徑過大，若結(jié)合微射流均質(zhì)法能使脂質(zhì)體的粒徑減小，有利于均勻分散。因此，最終選擇薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體。

本實驗首先進(jìn)行單因素考察蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體的處方與工藝，對有機(jī)溶劑種類的選擇、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、超聲時間、水化溫度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介質(zhì)的選擇、微射流壓力對包封率的影響進(jìn)行了單因素實驗。實驗結(jié)果表明，磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響較大，而水化溫度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介質(zhì)的選擇、旋蒸溫度對包封率的影響較小，因此選取影響較大的3個因素確定影響范圍，通Box-Behnken響應(yīng)面法的進(jìn)行蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體工藝優(yōu)化。

本實驗在單因素考察的基礎(chǔ)上，選用薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體，以包封率為主要指標(biāo)，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法試驗篩選出蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體的最佳處方工藝和制備工藝。工藝驗證結(jié)果表明：測得包封率和載藥量較高，且粒徑也符合肝靶向要求，說明采用此法制備蟾酥提取物長循環(huán)納米脂質(zhì)體工藝穩(wěn)定，科學(xué)合理。