過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的微射流高壓均質(zhì)制備工藝流程

心臟死亡器官捐獻(xiàn)手術(shù)中的熱缺血過(guò)程嚴(yán)重影響了供體器官的質(zhì)量，腎臟受到缺血損傷會(huì)導(dǎo)致移植后生存率的下降及術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)。為了解決這一臨床問(wèn)題，研究人員設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種基于全氟化碳的過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒復(fù)合體，結(jié)合了二氧化錳的過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)氧能力和全氟化碳*的溶氧釋氧性質(zhì)，達(dá)到了“產(chǎn)氧-儲(chǔ)氧-釋氧”為一體的氧自供效果。

人血清白蛋白由肝細(xì)胞生產(chǎn)，是人體血漿中含量豐富的蛋白質(zhì)，對(duì)于維持機(jī)體滲透壓、結(jié)合及運(yùn)輸一些內(nèi)源性物質(zhì)（膽紅素、脂肪酸等）及外源性物質(zhì)（大多數(shù)藥物、金屬離子等）具有極其重要的意義。近年來(lái)，由于其良好的生物相容性、特別的空間結(jié)構(gòu)及相對(duì)簡(jiǎn)單又豐富的制備方法，許多研究都將白蛋白作為一種理想的納米藥物載體。

本研究利用高錳酸鉀的強(qiáng)氧化性，以具有還原性的人血清白蛋白為模板進(jìn)行原位生物礦化得到二氧化錳白蛋白納米粒，利用白蛋白展開(kāi)與再折疊的自組裝方式形成的納米乳劑將極度疏水的氟碳化合物包載在白蛋白疏水空腔內(nèi)得到最終具有供氧功能的過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒復(fù)合體。本文主要就過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的微射流高壓均質(zhì)制備工藝流程及其基本理化性質(zhì)（包括粒徑大小、化學(xué)組成）進(jìn)行闡述及表征

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

粒度分析及電位儀美國(guó)Brookhaven

紫外分光光度計(jì)日本島津UV-2450

透射電子顯微鏡日本電子株式會(huì)社（JEOL）

超聲細(xì)胞破碎儀南京先歐有限公司

微射流高壓均質(zhì)機(jī)WST-NANO

恒溫水浴攪拌器IKA

分析天平日本島津制作所

超濾杯德國(guó)Millipore8400

離心機(jī)德國(guó)Eppendorf

氣相色譜儀日本島津GC-2014C

實(shí)驗(yàn)方法：

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的制備工藝：

稱取126.4mgKMnO4粉末溶解于12mL去離子水中，超聲充分溶解。取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去離子水稀釋到28mL（使終濃度35.7mg/mL），放入37℃恒溫水浴并攪拌情況下，將KMnO4溶液在5分鐘之內(nèi)逐滴加入到白蛋白溶液中，溶液顏色逐漸變?yōu)樽睾谏^續(xù)水浴磁力攪拌反應(yīng)兩小時(shí)。加入去離子水稀釋制備的二氧化錳白蛋白納米粒至100mL，超濾除去游離的KMnO4，反復(fù)超濾兩次，直至流出液為無(wú)色透明，最終得到40mL二氧化錳白蛋白納米粒體系。取7.22mLFDC與3.14mLFMCP，混勻后加入到稀釋好的二氧化錳白蛋白溶液中，使用移液槍反復(fù)吹打多次使全氟化合物在體系中分散均勻，方便超聲乳化。

將上述混合溶液置于冰浴，用超聲細(xì)胞破碎儀以35%的功率超聲4個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)超聲2分鐘）共8分鐘，得到過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒初乳。將初乳使用微射流高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（以下百分?jǐn)?shù)均為均質(zhì)機(jī)總功率百分?jǐn)?shù)），10%，1min；30%，1min；50%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，放出；20ml體系，均質(zhì)一個(gè)循環(huán)用時(shí)20s左右，65%壓力下共微射流均質(zhì)4min，即12個(gè)循環(huán)。

設(shè)置不含二氧化錳的對(duì)照組納米粒PHNs，制備流程如下：取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去離子水稀釋到40mL（使白蛋白終濃度為25mg/mL）。加入7.22mLFDC和3.14mLFMCP，反復(fù)吹打混勻后使用超聲細(xì)胞破碎儀超聲乳化，進(jìn)而使用微射流均質(zhì)機(jī)均質(zhì)得到最終制劑PHNs。超聲方法及微射流均質(zhì)方法同上述制備過(guò)程。

結(jié)果

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的制備工藝

在這里，我們使用了一種簡(jiǎn)單的一步原位生物礦化方法制備得到了二氧化錳白蛋白納米粒，同時(shí)使用超聲乳化方法將全氟化碳FDC和FMCP包裹在白蛋白疏水核心，得到具有供氧能力的過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒。如圖1所示，過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒溶液在自然光線下看呈透亮的棕黑色，溶液體系澄清透亮，迎著光線看可見(jiàn)微微乳光。

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的照片

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的粒徑分布及電位

經(jīng)Brookhaven電位與粒度儀測(cè)定，PHNs與M-PHNs的粒徑大小和分布情況如圖2所示，電位大小如圖3所示。可以看出，PHNs的平均水合粒徑為148nm，表面電位為-24.7mV，相比較之下，修飾了二氧化錳的M-PHNs其粒徑略微增大至157nm，表面電位下降至-30.7mV。同時(shí)，兩種納米粒的粒徑多分散系數(shù)（PDI）均小于0.15，證明本研究中所用的納米藥物粒徑分布較為均勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們所制備的M-PHNs納米氧氣發(fā)生器具有合適的粒徑大小，適用于后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。表面電位的負(fù)電性增大也能夠證明二氧化錳的成功修飾，并且電位偏負(fù)電性的納米粒由于在生物體中對(duì)細(xì)胞的非特異性吸附小使得這類納米粒子具有優(yōu)異的血液相容性，這些特殊的理化性質(zhì)為接下來(lái)細(xì)胞及動(dòng)物模型中的探索奠定了基礎(chǔ)。

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的粒徑分布情況

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的電位大小

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的紫外吸收光譜

為了進(jìn)一步驗(yàn)證M-PHNs中二氧化錳的存在，對(duì)M-PHNs及PHNs納米粒進(jìn)行200-900nm的全波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光掃描（圖4），從圖中可以看出，相比于沒(méi)有二氧化錳的PHNs納米粒而言，過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒在380nm左右有一個(gè)明顯的吸收峰，與文獻(xiàn)調(diào)研的二氧化錳的376nm的特征紫外吸收峰重合，而PHNs納米粒在此位置并無(wú)明顯吸收峰，從而驗(yàn)證了過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒中二氧化錳的存在。而200-300nm的高紫外吸收是由于納米粒中的白蛋白引起的，這一位置的吸收曲線在M-PHNs以及PHNs的吸收?qǐng)D譜中高度重合。

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的特征紫外吸收光譜

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的氣相色譜圖

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒中具有攜氧釋氧功能的核心是FDC和FMCP兩種全氟化合物。由于全氟化合物是一種化學(xué)惰性物質(zhì)，其疏水疏油的性質(zhì)給全氟化合物的檢測(cè)帶來(lái)了巨大的困難。因此在本研究中，我們利用兩種全氟化合物之間沸點(diǎn)的差異使用氣相色譜檢測(cè)的方法驗(yàn)證M-PHNs中FDC和FMCP的存在。其中，商品化的FDC是由順式和反式兩種同分異構(gòu)體組成的混合物，因此，在氣相色譜圖中，FDC在保留時(shí)間7.5分鐘左右有兩個(gè)峰形相似的特征峰，代表FDC的兩種同分異構(gòu)體（圖5b）。同樣地，商品化的FMCP由于純度為96%，因此在氣相色譜圖中有四個(gè)特征峰，保留時(shí)間分別為10.31分鐘、10.44分鐘、11.23分鐘和11.39分鐘（圖5c）。對(duì)于待測(cè)樣品過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒，從結(jié)果上可以看到樣品的氣相色譜圖中同時(shí)具備FDC以及FMCP的特征峰，分別在保留時(shí)間7.29分鐘、7.66分鐘（FDC）以及10.28分鐘、10.45分鐘、11.11分鐘、11.27分鐘（FMCP），充分說(shuō)明過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒樣品中含有FDC以及FMCP 圖5 

過(guò)氧化氫響應(yīng)性白蛋白納米粒的氣相色譜圖